ATCC细胞库的原理在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
 

　　细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

 

　　ATCC细胞库培养方法：

　　1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

　　①弃去培养上清，用PBS或盐水清洗1-2次；

　　②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

　　③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

　　④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

　　⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

　　⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

 

　　2、细胞复苏：

　　①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

　　②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

 

　　3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

　　①弃去培养上清，用PBS或盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶；

　　②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

　　③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

　　④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。