白介素（Interleukin, IL）作为免疫调节的核心信号分子，其定量检测在炎症研究、肿瘤免疫治疗及自身免疫病诊断中具有关键价值。然而，ELISA检测的灵敏度（pg/mL级）与特异性易受操作细节影响，稍有不慎即导致数据失真。本文系统梳理白介素elisa试剂盒使用的全流程注意事项，助力科研人员获取可靠检测结果。
 

　　一、实验前"三查两备"核心准备

　　1.试剂完整性核查

　　确认微孔板密封完好，无翘起或破损

　　检查标准品管壁无结晶析出（如有需37℃水浴助溶）

　　验证生物素化抗体与酶结合物溶液澄清无沉淀

　　2.仪器适配性验证

　　酶标仪波长设置：主波长450nm，参比波长630nm

　　洗板机流速校准：确保每孔残留液≤2μL

　　温育箱温度波动控制在±0.5℃

　　3.样本预处理规范

　　血清/血浆样本：3000rpm离心10分钟，避免反复冻融（≤3次）

　　细胞上清：收集后立即检测或-80℃保存，禁止添加蛋白酶抑制剂

　　组织匀浆：按1:10（w/v）加入预冷PBS，冰浴超声破碎

　　二、操作过程"五禁三控"黄金法则

　　1.五禁原则

　　禁止孔间交叉污染：加样时使用多通道移液器，避免液体溅溢

　　禁止标准品复溶后久置：稀释后的标准品需在2小时内使用完毕

　　禁止直接在微孔板上标记：使用可拆卸的96孔架记录样本顺序

　　禁止酶结合物暴露强光：操作时需在暗盒或黄光下进行

　　禁止使用金属浴温育：塑料微孔板与金属表面热传导差异会导致边缘效应

　　2.三控要点

　　温育时间控制：所有孵育步骤严格按说明书计时，超时10分钟将使OD值偏差＞15%

　　洗板次数控制：拍干操作需用专用吸水纸，禁止用力敲击导致孔壁刮伤

　　显色时间控制：加入TMB底物后，根据室温动态监测（25℃时显色时间≤30分钟）

　　三、结果分析"双保险"策略

　　1.标准曲线质控

　　R²值需≥0.99，否则需重新绘制

　　最小检测限（LLOD）应低于临床参考值下限的1/3

　　2.异常值处理

　　复孔CV＞15%的样本需重新检测

　　超出标准曲线范围的样本需用白介素elisa试剂盒配套稀释液进行梯度稀释

　　四、特殊场景应对方案

　　1.高脂样本处理：加入等体积异丙醇沉淀蛋白，12000rpm离心后取上清检测

　　2.溶血样本补救：添加1% BSA封闭非特异性结合位点，同时设置溶血对照孔

　　3.基质效应消除：对复杂样本（如脑脊液）采用标准品加入法（Standard Addition）进行校正

　　在IL-6检测中，严格遵循上述规范可使批内变异系数（CV）从18%降至5%以下，回收率稳定在95%-105%区间。随着化学发光ELISA与微流控芯片技术的融合，白介素检测正迈向更高通量、更精准的新阶段，但规范操作始终是获取可靠数据的基石。